Профессор Запускалов Игорь Викторович, Кривошеина Ольга Ивановна (Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск, Россия).
Медико-социальная значимость воспалительных заболеваний роговой оболочки определяется их чрезвычайно высокой распространенностью, а также нередко тяжелыми исходами.
Широкое применение антибактериальных препаратов на современном этапе обусловило изменение этиологической структуры гнойных поражений роговицы с возрастанием удельного веса условно-патогенной микрофлоры.
В настоящее время очевидны серьезные негативные последствия традиционной антибактериальной терапии: развитие дисбактериоза и присоединение грибковой инфекции, рост числа антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, развитие аллергических реакций.
Трудности лечения язв роговицы в значительной степени связаны и с тем, что в 30-44,8% случаев не удается выделить возбудителя заболевания, и лечение проводится эмпирически, с учетом клинической картины.
Неудовлетворенность результатами традиционной фармакотерапии, высокая частота развития осложнений обусловливают поиск и разработку новых методов лечения язв роговицы.
В публикациях последних лет появились сообщения об участии цитокинов в регуляции воспалительных и регенераторных процессов в тканях глаза. Цитокины, вырабатываемые, преимущественно, мононуклеарами крови, представляют собой единую самостоятельную систему регуляции функций организма, обеспечивающую развитие защитных реакций и поддержание гомеостаза при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей. На местном уровне цитокины ответственны за все последовательные этапы развития
адекватного ответа на внедрение инфекционного агента, обеспечение его удаления, а также восстановление структуры поврежденной ткани.
Цель: в эксперименте in vivo изучить закономерности течения воспалительно-регенераторных процессов при стромальных дефектах роговицы на фоне местного применения аутологичных мононуклеаров крови.
Материалы и методы.
Выполнена серия экспериментов на 48 половозрелых крысах-самцах породы Wistar массой 250 г и 20 кроликах породы Шиншилла массой 2,5-4,0 кг.
В 1-й серии экспериментов моделировали язву роговицы посредством одномоментного интрастромального введения монокультуры Staph. aureus (штамм 209 P) в сочетании с полной
деэпителизацией роговицы. Под эфирным наркозом каждому животному выполняли деэпителизацию роговицы обоих глаз и интрастромально вводили 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия, содержащего культуру Staph. aureus из расчета 2 млрд. микробных тел на 1,0 мл.
Лечение начинали на 3-и сут. после инфицирования роговицы и развития экссудативно-деструктивного воспаления.
В зависимости от способа лечения животные были разделены на 2 группы:
- основную (n=24) - животным, наряду с инстилляциями раствора Ципролет®, Ciprolet 6 р. в д., проводили инстилляции аутологичных мононуклеаров крови с аналогичной частотой. В ходе лечения инстилляции мононуклеаров повторяли 4 р. с интервалом 3 д.;
- сравнения (n=24) - животным выполняли только инстилляции раствора ципролета с частотой 6 р. в д. Общая продолжительность эксперимента составила 19 сут.
Во 2-й серии экспериментов выполнялась тотальная деэпителизация роговицы и механическое повреждение стромы и эндотелия роговой оболочки одного из глаз.
В зависимости от способа лечения, которое начинали через сутки после индуцированного повреждения роговой оболочки, животные были разделены на 2 группы:
- основную (n=10) - животным, наряду с инстилляциями раствора ципролета 6 раз и корнерегеля 3 р. в д., в строму роговицы однократно вводили аутологичные мононуклеары крови; - сравнения (n=10) - животным после повреждения роговицы выполняли только инстилляции ципролета 6 р. и корнерегеля 3 р. в д.
Общая продолжительность эксперимента составила 21 суток.
Мононуклеары, взятые из крови экспериментального животного непосредственно перед манипуляцией, выделяли методом фракционирования в градиенте плотности на разделяющем растворе фиколл-верографин. Чистота клеток составляла 96-98%, жизнеспособность клеточного материала - 97-98%. В ходе экспериментов проводили наружный осмотр, биомикроскопию, флюоресцентную пробу, фоторегистрацию. Забор материала производили на 3, 7, 14, 21 сутки от начала экспериментов.
Полученный материал фиксировали для световой микроскопии. Морфометрическое исследование включало подсчет клеточных элементов в окулярной рамке на площади 900 мкм2.
Цифровой материал обработан общепринятыми методами вариационной статистики. Для оценки достоверности различий при сравнении средних величин использовали непараметрический критерий Манна- Уитни.
Результаты.
Динамика течения язвы роговицы на фоне инстилляций аутологичных мононуклеаров крови.
Средний срок купирования воспаления в основной группе по сравнению с группой сравнения сократился в 1,6 раза (р‹0,05), составив 9,1+/-0,17 и 15,4+/-0,18 сут. соответственно. Рассасывание инфильтрации и отека стромы роговицы в основной группе ускорилось на 43% (р‹0,05), завершившись к 9,4+/-0,16 сут., в группе сравнения данный процесс завершился лишь к 16,5+/-0,18 сут.
Рассасывание гипопиона в основной группе ускорилось в 1,94 раза (р‹0,05).
В более ранние сроки в основной группе в отличие от группы сравнения началась эпителизация роговицы (6,8+/-0,28 сутки и 8,7+/-0,25 сут. соответственно) (р‹0,05).
Применение аутологичных мононуклеаров крови в сочетанном с инстилляциями раствора ципролета лечении язв роговицы позволило в 3,9 раза (р‹0,05) сократить число осложнений заболевания: в основной группе в 12,5% наблюдали развитие десцеметоцеле. В группе сравнения, помимо десцеметоцеле в 18,7%, в 14,6% отмечена перфорация
роговицы и в 14,6% - эндофтальмит, завершившиеся субатрофией глазного яблока.
В ходе морфологических исследований получены следующие результаты.
На 3-и сут. после инфицирования роговицы у животных обеих групп до начала лечения на роговице обнаруживался обширный участок воспалительной инфильтрации с явлениями некроза в центре толщиной 0,37+/-0,003 мм. Перифокально отмечался выраженный отек стромы роговицы. Воспалительная инфильтрация была представлена, преимущественно, полиморфно-ядерными лейкоцитами (ПМЛ) (92+/-1,0 клеток в поле зрения).
На 7-е сут. в основной группе отмечалось уменьшение площади воспалительной инфильтрации и перифокального отека роговицы. При этом отсутствовали явления некро за стромы. Клеточный состав инфильтрата был представлен ПМЛ (49,5+/-2,0) и мононуклеарными фагоцитами (7,3+0-1,5). В группе сравнения сохранялся участок некроза толщиной 0,27+/-0,04 мм. Среди клеток инфильтрата преобладали ПМЛ (67,4+/-2,0).
На 14-е сут. в основной группе эпителий полностью покрывал поверхность роговицы. В зоне остаточной воспалительной инфильтрации преобладали мононуклеарные фагоциты (9,5+/-0,2) и фибробласты (10,1+/-0,1). В группе сравнения сохранялась воспалительная инфильтрация стромы роговицы без явлений некроза. Среди клеток преобладали полинуклеарные (29+/-0,1) и мононуклеарные (7,5+/-0,2) фагоциты. Наблюдалась активная эпителизация роговицы.
На 21-е сут. в основной группе наблюдалась полная эпителизация роговицы. В зоне воспаления обнаруживались компактно расположенные коллагеновые волокна. Уменьшалось число мононуклеарных фагоцитов - до 4,7+/-0,1 и фибробластов – до 6,7+/-0,1. В группе сравнения отмечалась полная эпителизация поверхности роговицы, наблюдалось активное
образование коллагеновых волокон. В клеточном ансамбле преобладали фибробласты (10,5+0-0,2) и мононуклеарные фагоциты (6,4+/-0,1). Количество ПМЛ сокращалось до 14,7+/-
0,2 клеток.
Динамика течения стромального кератита на фоне интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови.
Средний срок купирования воспаления в основной группе по сравнению с группой сравнения сократился в 1,7 раза (р‹0,05), составив 9,2±0,17 и 16,3±0,18 сут. соответственно. Резорбция перифокального отека и инфильтрации стромы роговицы ускорились на 42%, завершившись к 9,5±0,17 сут.
В группе сравнения данный процесс завершился к 17,2±0,18 сут. (р‹0,05). Эпителизация роговицы в основной группе наступила в достоверно более ранние сроки, чем в группе сравнения - 7,2±0,17 и 11,0±0,16 сут. соответственно (р‹0,05).
На фоне интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови при лечении повреждений роговицы отмечено сокращение числа осложнений заболевания в 5,0 раз. В ос-
новной группе в 10% наблюдалось развитие десцеметоцеле, в группе сравнения десцеметоцеле наблюдалось в 30%, в 20% возникла перфорация роговицы, завершившаяся субатрофией глазного яблока.
В ходе морфологических исследований получены следующие результаты.
На 3-и сут. от начала эксперимента в основной группе эпителий роговицы был представлен 5-6 слоями плоских клеток. Подлежащая пограничная мембрана визуализировалась на всем протяжении. В строме отмечалась диффузная мононуклеарная инфильтрация (96±1,0 клеток в поле зрения). Десцеметова мембрана и эндотелий определялись не на всем
протяжении.
В группе сравнения эпителий роговицы был представлен дистрофически измененными эпителиоцитами. Передняя пограничная мембрана визуализировалась не на всем протяжении. Подлежащая строма роговицы характеризовалась выраженным отеком, коллагеновые волокна в ней располагались в виде рыхлой сети. Воспалительная инфильтрация была представлена ПМЛ (95±1,0). Эндотелий роговицы на большем протяжении десквамирован.
На 7-е сут. в основной группе эпителий роговицы был представлен 5-6 слоями плоских клеток. Базальные эпителиоциты активно пролиферировали. Передняя пограничная мембрана
хорошо визуализировалась на всем протяжении. В строме роговицы ход коллагеновых пучков становился упорядоченным.
В области лимба сохранялось диффузное скопление мононуклеарных фагоцитов (78±1,0). Эндотелий роговицы сохранялся практически на всем протяжении и был представлен одним слоем пролиферирующих эпителиоцитов. В группе сравнения клетки эпителия располагались в 6-7 слоев и имели кубическую форму. На поверхности эпителия обнаруживались очаговые отложения фибрина. В передней трети стромы отмечалось уменьшение отека, в задней части роговицы пучки коллагеновых волокон были расслоены отечной жидкостью и имели волнообразный ход.
В собственном веществе роговой оболочки обнаруживались полинуклеарные (68,4±1,0 клеток в поле зрения) и мононуклеарные фагоциты (23,7±0,1), новообразованные сосуды. Эндотелий роговицы представлял собой один ряд плоских клеток, местами был слущен.
На 14-е сут. в основной группе эпителий роговицы содержал 4-5 слоев плоских клеток. В строме роговицы отмечалось уменьшение численности мононуклеаров (27±0,1). Строма роговицы содержала упорядоченно расположенные пучки коллагеновых волокон. Эндотелий был представлен одним слоем призматических клеток.
В группе сравнения эпителий роговицы состоял из 4-5 слоев плоских клеток. В задней трети стромы собственное вещество роговицы было гомогенным, при этом дифференцировать волокнистые структуры не представлялось возможным вследствие деструкции основного вещества.
В клеточном составе преобладали мононуклеарные фагоциты (59,4±0,1), располагающие в виде скоплений вокруг сосудов. Количество ПМЛ сокращалось до 15,3±0,2 клеток. В области лимба в строме роговицы обнаруживались сосуды.
На 21-е сут. в основной группе эпителий роговицы содержал 4-5 слоев плоских клеток. Передняя и задняя пограничные мембраны определялись на всем протяжении. В области лимба сохранялась незначительная мононуклеарная инфильтрация (5,3±0,2). Строма роговицы имела нормальное строение и была представлена упорядоченно расположенными коллагеновыми волокнами.
В группе сравнения эпителий роговицы имел нормальное строение. Передняя пограничная мембрана определялась на всем протяжении, однако была несколько утолщенной. На уровне передних двух третьих стромы отмечались активное образование коллагеновых волокон и новообразованные сосуды, вокруг которых сохранялись очаговые скопления мононуклеарных клеток (14,5±0,1). В задней трети стромы сохранялись отек и гомогенизация волокон, дифференцировать волокнистые структуры или ядра клеток было невозможно.
Таким образом, на фоне локального применения аутологичных мононуклеаров крови в лечении экспериментальных стромальных кератитов значительно уменьшается продолжительность и выраженность воспаления, отмечается быстрая смена клеточных фаз в патологическом очаге и активизируется процесс регенерации поврежденных роговичных структур.
Примечание
Благодарим профессора Балашову Ларису Маратовну за помощь в подготовке материала.
Внимание! Данная информация предназначена исключительно для ознакомления.
Любое применение опубликованного материала возможно только после консультации со специалистом.
Разрешается некоммерческое цитирование материалов данного раздела при условии полного указания источника заимствования: имени автора и WEB-адреcа данного раздела www.dry.eye-portal.ru, www.organum-visus.com